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2015年11

培训总结


 

旱区作物逆境生物学国家重点实验室 黄雪玲

 

  

植物生理学与生物化学国家重点实验室与农业生物技术国家重点实验室坐落于中国农业大学西校区的同一栋楼内。与植物病虫害生物学国家重点实验室相比,由于是大学内的实验室,学生很多,仪器使用率也高。不同于植物病虫害生物学国家重点实验室,重点实验室有更严格的门禁系统,类似于我校图书馆。进门后大厅的布局很温馨,娄成后先生的雕像坐落于大厅的一侧,时刻激励着一代又一代科研工作者勇往直前。大厅的南面还有沙发和茶几,供往来的人临时休息。楼内还有设施较好的会议室,门口的接待人员也彬彬有礼,这一切可能要归功于整栋楼的物业完全外包。这些都是值得我们实验室借鉴的地方。

参观整个植物生理学与生物化学国家重点实验室,给人一种高、大、上的感觉,但是又绝不浮夸。明亮的玻璃房里面坐落着各种大型仪器设备,三三两两的科研工作者正开展着实验工作。实验室的大型仪器利用率都很高。电子显微镜区域非常繁忙,多台切片机都正在工作。实验室共有4台激光共聚焦显微镜,参观过程中有三台都正在使用过程中。管理激光共聚焦显微镜的只有一名老师,看上去并不繁忙。一打听才知道,这里的实验技术人员不负责做样、观察,他们的任务只是培训会每一个要来做实验的人。授人以鱼不如授人以渔,这样既教会了别人本领,也能让自己腾出时间干其它工作。相比较之下,我们重点实验室的工作人员要累的多,给学生制样,带着学生观察是常有的事情,所以,这一点,非常值得我们实验室学习。

 

离心机室存放着各式离心机,有冷冻离心机、超速离心机和分析型离心机等等。在离心机房里,我还看见了一个四度冰箱,问了带领参观的老师才知道,原来常用的转头都存放于此,实验的时候就可以直接取用了。看到这里,我才恍然大悟,我每次使用超速离心机都要学生提前告诉我,因为降温需要2小时。学习了先进经验,以后我们也可以进一步提高服务质量。

参观结束,负责老师给我展示了植物生理学与生物化学国家重点实验室内部仪器预约系统。原来每台仪器都有专门的刷卡装置,这样老师在电脑旁可以看到所有仪器状态,包括哪些仪器被预约使用,哪些仪器正在运行,哪些仪器需要收费,已经收取的费用金额。原来仪器能高效运行的原因在这里。

2 实验操作技术

在培训期间,我还专门学习了三台大型仪器的操作技能,现做以汇报。

1)        高分辨率溶解曲线分析系统

高分辨率溶解曲线分析系统(Light scanner HRM高分辨率熔解曲线)由美国Idaho公司生产,是世界上第一台利用HRM技术对96或者384孔板PCR产物进行基因突变扫描和基因分析的HRM仪器。可用于测序前的大规模突变筛查及基因分型工作,使测序的工作量降低为原来的1%。此外Light Scanner还可以检测到体细胞样品中比例低至0.1%的突变,特别适用于突变及流行病学大规模筛查。其主要的研究方向集中在: 1 、基因未知突变以及 SNP 的扫描; 2、已知突变及 SNP 的基因分型; 3、动植物、微生物等物种的物种鉴定以及品种鉴定; 4 、法医鉴定、亲子鉴定; 5 HLA 的配型; 6 、甲基化的研究等。

完整的Light Scanner系统包括:

1 Light Scanner 96/384仪器及计算机控制系统。

2.、高分辨的饱和LC Green荧光染料试剂和高性能的PCR Master Mix试剂。

3 智能化的软件包括仪器控制、数据采集、数据分析、引物设计和数据管理等软件模块。

实验操作步骤:

应用一:未知SNP扫描(Mutation Discovery

设计引物,扩增目的片段(一般为100400bp大小),在PCR之前掺入LC Green荧光染料,针对扩增的目的片段进行HRM分析,可找出新的未知SNP

应用二:已知SNP位点基因分型(Genotyping

方法一: Small Amplicon法进行已知SNP位点基因分型:针对已知SNP位点设计小片段(一般片段大小50100bp),PCR前掺入LC Green荧光染料,对PCR产物进行HRM检测,采用Small Amplicon分析,可以给出该SNP位点的3种基因型。

方法二:Luna Probe(非标记探针)法进行已知SNP位点基因分型:针对已知SNP位点设计2035bp Luna Probe(非标记探针,与普通引物价格相当),PCR前掺入LC Green荧光染料,针对PCR产物进行HRM检测,采用Luna Probe分析,可以给出该SNP位点的3种基因型。

2)        实时荧光定量PCR

植物病虫害生物学国家重点实验室拥有四台Applied Biosystems 7500 Fast荧光定量PCR仪。由于对荧光定量PCR仪的技术已掌握,本次学习的目的主要是比较其它品牌仪器的优劣,为将来实验室仪器的购置做好调查。

1、产品特点

1.使用经过充分优化的快速循环方式,可在短短30分钟内得到高质量的结果。

2.独特设计的加热快速块可在极速运行的时候保证温度均一性,该加热模式比我们正在使用的CFX96要先进。

3.支持包括基因表达分析、绝对定量、SNP基因分型和包含内部阳性对照的实验在内的一系列应用。配合Applied Biosystems最新的HRM软件,还可以进行高分辨率熔解曲线分析。

2、技术参数

1.热循环系统: Peltier效应系统

2.光学系统:卤钨灯。CFX96使用的是LED灯,寿命虽长,但是强度不如卤钨灯。

3.通道数: 5色荧光通道

4.最高升/降温速率: 96孔(快速):4.8 C/s 

5.温度均一性: +/- 0.5 C35-95 C30秒后)

6.控温精确性:+/- 0.25 C35-95 C3分钟后)

7.系统可升级性:硬件可以升级至964色荧光通道或 HRM 模块

通过以上参数可以看出,Applied Biosystems 7500 Fast的光源质量要更好,但是温度控制的精确性及升降温速率不如CFX96。通过具体的实验操作发现,Applied Biosystems 7500 Fast的使用界面较复杂,不宜上手。但是通过与实验技术人员的交流,发现该仪器性能稳定,故障率低,这方面有着CFX96不可比拟的优势。

3)        毛细管电泳仪

毛细管电泳(capillary electrophoresisCE)是80年代初发展起来的一种基于待分离物组份间淌度和分配行为差异而实现分离的电泳新技术,以内径20-200μm的柔性毛细管柱为分离通道,以高压直流电场为驱动力,具有快速、高效、分辨率高、重复性好、易于自动化等优点,广泛应用在蛋白及多肽、氨基酸、核酸、生物小分子、手性拆分、糖分析、药物分析等诸多领域。

毛细管电泳的几种分离模式

  毛细管电泳根据分离机理等不同,分成几种分离模式,主要为以下几种:

1.自由溶液毛细管电泳(FSCE)或称毛细管区带电泳(CZE)

毛细管中只充有电泳缓冲液,根据被分析物的荷质比差异进行分离。应用最广泛、已见报道的例子有多肽、蛋白质和核酸等生物大分子的分离以及无机离子、氨基酸、药类等小分子的分析。

2.毛细管等电聚焦(CIEF)

根据蛋白质和多肽的等电点进行分离。此方法除了能测定蛋白质和多肽的等电点外,还可鉴定蛋白质的纯度及分析不同变异体。

3毛细管凝胶电泳(CGE)

根据被分析物的荷质比分离,当凝胶中含有SDS等去垢剂时,则根据它们的分子大小进行分离。主要用于蛋白质、部分多肽和DNA分离。

4.微团电动毛细管色谱(MECC)

此方式主要用于小分子(如氨基酸等)和多肽的分离。

毛细管电泳在生命科学中的应用

1.在多肽研究中的应用

毛细管电泳可以分辨多肽的细微结构差异,如C一端的酰胺化与去酰胺化,单个氨基酸残基的替换,氨基酸组成相同而序列不同的多肽也能区别开。

2.在蛋白质研究中的应用

毛细管电泳采用温和非变性条件,有利于分析蛋白质的细微结构差异并鉴定蛋白质的纯度。由于毛细管电泳分析快速,可用来监测蛋白质化学反应的动力学过程。

3在核酸研究中的应用

核酸分离主要是将不同大小片段分开,由于含有不同个数碱基对的DNA分子(即长度不同)其荷质比相同,因而用自由溶液毛细管电泳不能将它们分离。应用毛细管凝胶电泳模式可解决这一问题。  

通过本次培训,我拓宽了视野,也学习到很多先进的管理经验和实验操作技术。非常感谢科学技术发展研究院及旱区作物逆境生物学国家重点实验室的大力支持,我将继续勤奋工作,将学到的先进经验、技术与我们的具体实际相结合,为进一步提高服务水平和质量而努力!